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上海洽姆儀器科技有限公司-酸性藍-1|SUPELCOSIL LC-18-S 色譜柱|SUPELCOSIL LC-18-DB 色譜柱

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液相色譜柱知識分享和選擇技巧!

發布時間:2019-03-15


液相色譜柱知識分享和選擇技巧!


   現代高效液相色譜分析中,色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞,選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發所需的時間,并且使方法更具穩定性。但是現在市場上色譜柱種類繁多,不同類型的色譜柱分離對象不同,因此,要做合適的選擇,必須對此有一定的認識和了解。

  色譜柱參數

  物理性質

  柱長,內徑,如250*4.6mm。一般柱長在2—250mm,柱越長,分離度越高,但柱壓更高,分離所需時間更長;但分離度與理論塔板數的平方根成正比,所以一昧增加柱長并不是最有效的分離手段,一般情況下,150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數。

  

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  粒徑,影響色譜分離度。粒徑越小,分離越快,柱效越高,但柱壓力越高,柱容易被污染,導致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料,復雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑,更大內徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍,因此如何選擇填料粒徑需要根據現實情況而定。

  

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  孔徑,60A,120A,300A等??讖叫?,則含孔率高,比表面積大,載碳量高;色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配,保證分子自由進出填料孔并與孔內表面的鍵合相進行分離分配,通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上,一般小分子使用80—120A,大分子使用300A。

  

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  顆粒形狀,一般有球形和不規則形,當使用黏度較大的流動相時,球形顆??梢越档椭鶋?,延長色譜柱壽命。

  

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  比表面積,指的是每克填料的表面積,如180m2/g—350m2/g,與粒度和含孔率有關;比表面積大,會增加樣品與鍵合相之間的反應,增加保留和分離度;比表面積小則可以縮短分析時間和平衡時間,并不是比表面積大或者小就更好,需要選擇合適的比表面積。

  化學性質

  硅膠基質:最通用的基質,強度大,化學修飾容易,但使用的pH值范圍有限(一般為2—8,特殊修飾的可以達到1—12)。

  聚合物基質:多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂,化學穩定,應用pH范圍寬,具有更強的疏水性,對蛋白質等樣品分離效果較好;但強度較小,有機溶劑可能導致聚合物溶脹而受損,批次重復性較差,商品化色譜柱不多,一般價格較貴。

  載碳量:基質表面鍵合相的比例,載碳量高,則保留增加,適合分析非極性化合物。

  鍵合相:鍵合試劑不同,對化合物的選擇性不同,一般長鏈的烷基鍵合相(C18 C8)比短鏈的(C4 C3)穩定;非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩定。

  封端:用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來,以減少殘留的硅醇基,減輕待測組分與酸性硅羥基反應而引起的色譜峰拖尾現象。尤其對于極性樣品而言,未封端處理的色譜柱分離效果較差。

  正相&反相色譜

  目前市場上主要以反相色譜為主,約占80%的比例。 

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  在了解了色譜柱的基本知識后,色譜柱的選擇也就迎刃而解了。

  柱長及內徑的選擇

  長度的選擇:柱越長,總柱效越高(n值越大),柱越長,分析時間也越長。250—300mm是最普遍的柱長,實驗室一半以上的工作都是采用此規格柱子,一般用來分離l0到50個組份的中等至復雜混合物;500—600mm,要求較高分辨率的應用,—般用來分離大于50個組份或包含有難分離物質的復雜樣品程序升溫分析。

  內徑:柱效率與柱半徑平方成反比,內徑越小柱效越高,但內徑越大,柱容量也增加,允許進樣量就越多。當進樣量超過柱容量時,則因柱內每塊理論板內不能建立真正的平衡,將會導致色譜蜂畸變,柱分辨率降低,重現性不好。因此對于復雜樣品需要精確分離,必須使用小內徑柱子。另一方面若樣品中存在具有很不相同濃度組份化合物,為了增加樣品容量就必須使用內徑大的柱子,目前實驗室使用最常見的柱子內徑一般是4.6mm。

  一般選擇原則:分析大分子量化合物選擇大孔徑色譜柱;對于高pH值或者堿性化合物需要選擇高封端或者特殊封端的色譜柱,以改善峰形,延長色譜柱使用壽命等。

  現在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目,根據色譜柱的參數可以給我們提供一個初步的選擇,但由于各個儀器廠商的填料技術和鍵合技術都有差異,即使都是C18柱,同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數,仔細閱讀色譜柱說明書,才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。


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